抗非大家谈|樊福好:非洲猪瘟检测瓶颈之核酸提取与纯化
点击: 网友评论: 时间:2019-10-21 14:51:53 来源:中国养猪第一网 作者:樊福好




非洲猪瘟“中国化”以来,关于该病毒实验室检测内容的讨论越来越多,取得的科技进展也越来越大。从样本的采集、运输、保存到核酸的提取、扩增,任何一个环节出现问题,都会大大降低非洲猪瘟病毒检测工作的敏感性。在2018年8月份和2019年3月份之间,这种检测敏感性较低的情况尤为突出。

 

唾液学检测具有较高的生产现实意义,该方法已经成为非洲猪瘟检测工作的首选方法。血液学检测过渡至唾液学检测的过程中,同样也出现了很多的问题,这些问题正在被逐步解决。

 

首先是唾液中病毒核酸被干扰的问题严重影响了唾液学检测技术的推广进度。唾液中的活性酶会大大缩短样本中目标核酸的半衰期,导致漏检率的居高不下,严重影响了定点清除(拔牙式清除)工作的效率。不过,随着各个试剂公司推出唾液样本保护液,该问题已经得到较好的解决。

 

根据近期实验室研究比对得到的情况,病毒核酸的提取和纯化再次成为约束唾液学检测的另外一个重要瓶颈,这个问题如果不能及时得到解决将大大阻碍明年春季非洲猪瘟疫情的防控工作。

 

非洲猪瘟病毒大多数存在于细胞之内,病毒核酸也被双层囊膜和多层蛋白质紧紧包裹,只有将病毒核酸彻底释放并纯化,才能实现核酸的有效扩增。在实际的实验室检测工作中,尤其是唾液学检测工作中,经常性出现漏检(假阴性)的情况,这些情况大大困扰了生产技术人员和实验室检测人员,严重制约了非洲猪瘟的定点清除工作和未来非洲猪瘟净化工作的效果。

 

根据现代生物技术研究的进展,病毒核酸的提取和纯化总体上分成三步:核酸释放、核酸纯化和收集。

 

各个试剂公司出品的试剂盒具有相对的不完备性,往往通过增加繁琐的步骤试图完成核酸的提取和纯化工作,但增加提取步骤会大大降低了核酸的得率。所以,简化操作过程将成为核酸提取和纯化研究的首要任务。

 

核酸释放:组织细胞内和病原体内的核酸释放可以通过反复冻融法、机械研磨法和化学裂解法进行。无论采用哪一种方法,内源性和外源性核酸酶都会降低核酸的得率。实际操作中往往通过采用较低的温度条件、快速的机械研磨或加核酸酶抑制剂等方法避免核酸酶的降解作用。

 

核酸纯化:裂解后的液体中除了含有核酸成分以外,还有大量的杂质,如蛋白、多糖以及其它化学物质。这些杂质不除去,可能会严重影响后续的核酸扩增。核酸纯化的常见方法有酚-氯仿法、膜吸附法和磁珠吸附法。由于使用了有毒有害的化学物质,酚-氯仿法基本上已经被弃用,而采用吸附法纯化核酸将成为未来的主流。

 

收集:核酸的收集比较简单,吸附在膜上或磁珠上的核酸可以用纯水洗脱。但是,为了提高核酸得率并保护核酸,可以用特殊的溶液进行洗脱。

 

 

EDTA会抑制后续的分子生物学反应,不建议使用TE进行核酸洗脱。

 

核酸提取与纯化(柱提法)的商品化套装应该包括:裂解液1瓶(建议使用棕色瓶,裂解液中要求包含助吸附成分(Binding buffer),减少操作步骤),清洗液1瓶(建议使用白色瓶,使用前加入适量无水乙醇或异丙醇),洗脱液1瓶,吸附柱(若干),简易说明书(1份)。

 

核酸提取与纯化的标准操作程序建议如下:

 

1.裂解:取离心管,管内加入待检液体样本100~200ul以及裂解液(Lysis buffer)600ul,轻摇、混匀;

 

2.吸附:吸附柱内加入无水乙醇300ul和上述裂解液体300ul(上述离心管内剩余的裂解样本可留作备份),1x10^4 rpm,30秒,弃液;

 

3.洗涤:吸附柱内加入600ul清洗液(Wash buffer),1x104rpm,30秒,弃液(重复此步骤1次)。弃液后,1x10^4 rpm,再次离心3分钟;

 

4.收集:更换套管,吸附柱内加入约50ul洗脱液(Rinse buffer),轻摇、混匀,1x10^4 rpm,30秒,保留滤液,冷冻保存,备用。

 

若采用该标准程序,基本上可以在10分钟之内完成核酸提取和纯化的操作步骤,大大缩短后续分子生物学操作的时间。

 

核酸提取与纯化的未来发展方向是:操作简单化、试剂环保化、核酸优质化。

 

操作简单化:尽量不使用酶类(如蛋白酶K等)成分,提高试剂存放的便捷性;减少操作步骤或实现机器自动操作。对于少量样本来说,人工提取的效率(得率)要高于机器提取的效率。

 

试剂环保化:避免提取和纯化试剂中包含有毒有害的物质,尤其是禁止使用挥发性有毒物质(如酚、氯仿、巯基乙醇、二硫苏糖醇等),这些物质可能会对实验室操作人造成身体的伤害。

 

核酸优质化:如果提取的核酸用于PCR等反应,建议提取总核酸(DNA和RNA),减少分步提取的繁琐程序,通过特殊的方法保持核酸一级结构的完整性并减少核酸之间的物理缠绕。对于猪群的检测来说,一次性提取的核酸可以用来检测猪瘟、蓝耳、非洲猪瘟、伪狂犬和环状病毒以及细菌感染等,大大减轻检测工作的负担。

 

综上所述,猪群病原的核酸检测工作研究任重道远,值得进一步深入探索。

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